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在选购单细胞空间成像平台时，由稀少接洽东说念主员衔尾的分析性能比较接洽可能会愈加客不雅并对您有所匡助。在此，咱们将重心先容近期的两项接洽，分别来自加拿大Lunenfeld-Tanenbaum接洽所的Cook等东说念主(1)和来自好意思国麻省理工学院和哈佛大学的Broad接洽所的Wang等东说念主(2)拳交 扩张，他们将10x Genomics公司的Xenium原位分析与NanoString公司的CosMx空间分子成像仪和Vizgen公司的MERSCOPE平台进行了比较。
重心归纳
这些接洽由不同的稀少接洽团队开展，对不同的单细胞空间成像平台进行了深远探究，其重心在于：
比较转录本检测的特异性
使用正交本领（RNA-seq和scRNA-seq）考证分析性能
专揽共有基因进行横向比较
评估细胞聚类、分割和转录本的空间散布
公开数据以便再次分析
咱们在第一部分索要了这些接洽的主要效果，您也不错不时向下阅读，深远了解作家们所作念的职责以及他们的效果！
主要效果：
#01-Xenium弘扬出更高的特异性
Cook等东说念主不雅察到基因检测转录本与阴性对照探针的比例：Xenium为372:1，CosMx为4.7:1
Wang等东说念主标明，关于测试的每种组织和基因组合类型，Xenium的特异性遥远高于MERSCOPE和CosMx（以诞妄发现率来掂量）
#02-Xenium在正交基准测试中弘扬出更高的一致性
Cook等东说念主标明，Xenium与snRNA-seq的关联性精熟，但CosMx对低抒发基因的计数有所夸大
Wang等东说念主指出，Xenium检测到的基因抒发水平比MERSCOPE高出2.6-13.6倍；Xenium检测到的抒发水平比CosMx高出12.3-14.6倍
#03-Xenium检测到共有基因中的更多转录本
Cook等东说念主不雅察到，Xenium检测到的每个基因的转录本数目约为CosMx的2倍；若仅限于两个平台间共有的基因，则Xenium检测到的每个细胞的转录本数目约为3倍
伦理小说txt下载Wang等东说念主发现，尽管Xenium的多重分析智商低于CosMx，但关于20种组织类型中的6种，Xenium检测到的私有基因总额多于MERSCOPE和CosMx，且检测到的on-panel基因占比最大
#04-Xenium梗概更好地检测和分辩细胞类型
Cook等东说念主标明，他们梗概通过Xenium分析自信地检测CD8+ T细胞和淋巴细胞，但在CosMx中却无法作念到
Wang等东说念主发现：
- Xenium和MERSCOPE齐能通过非重复的标识物基因明晰分辩6个细胞谱系，但CosMx只可分辩2个谱系
- 在几种组织类型中，Xenium飞动出的细胞类型遥远比CosMx和MERSCOPE更多
比较分析特异性以带领法律解释解释
为什么特异性很紧迫？
特异性在本案例中被界说为真实的生物学转录本而不是噪声在检出转录本中所占的比例，它是准确解释灵巧度（见下文）、动态范围偏抓他分析性能贪图的基础。
作家在这些接洽中如何使用特异性？
除了靶向感酷好基因的探针，Xenium原位分析和CosMx SMI还包括阴性对照探针。在Cook等东说念主的接洽中，作家通过比较基因靶向探针检测到的转录本中位数与阴性对照探针检测到的转录本中位数的比例来评估特异性。
Wang等东说念主指出，由于Vizgen MERSCOPE默许不包含阴性对照探针，他们必须选择不同的方法。为了细则系数三个平台的特异性，他们领先比较了在靶（on-target）转录本计数与阴性对照条形码（不合应任何基因探针的可检测条形码）的比例。
Wang等东说念主还专揽Xenium和CosMx齐包含解码对照和阴性对照探针的情况来筹商每个平台的诞妄发现率（FDR）。他们指出，尽管之前的筹商在对照和条形码的相对数目方面引入了偏倚，但FDR对这一干豫身分进行了归一化。
接洽东说念主员发现了什么？
Cook等东说念主发现，在CosMx SMI中，基因检测转录本中位数与阴性对照探针中位数的比例为4.7:1；而在Xenium分析中，这一比例为372:1（图1）。
图1. 对Xenium和CosMx SMI之间的在靶转录本检出与阴性对照探针的比例进行比较。图片历程授权，改编自Cook et al., 2023。
不异，Wang等东说念主发现，关于测试的三种组织类型，Xenium和MERSCOPE的在靶检出比例均高于CosMx。关于每种组织和基因组合类型，Xenium的FDR遥远比CosMx和MERSCOPE更低（即特异性更高）（图2）。
图2. 把柄FDR对Xenium、CosMx SMI和MERSCOPE之间的分析特异性进行比较。图片历程授权，改编自Wang et al., 2023。
作家得到了哪些启示？
Xenium和MERSCOPE在多种组织类型中遥远弘扬出高特异性。与MERSCOPE 或Xenium比拟，CosMx的各个基因弘扬出特征性的高涨弧线，标明它在低抒发景象下有着更泛泛的检出。这少量，再加上CosMx在多种组织中的特异性较低且诞妄发现率高，标明CosMx在检出低抒发基因时容易出错。
——Wang等东说念主
专揽正交本领进行基准测试以细则真实数据
为什么正交本领很紧迫？
熟识的正交本领，如RNA-seq或单细胞核RNA测序（snRNA-seq），不错匡助接洽东说念主员确保相对基因抒发水平、全体灵巧度和细则的分析动态范围反应真实的生物学，而不单是是噪声。
作家在这些接洽中如何使用正交本领？
Cook等东说念主对与Xenium和CosMx分析所用切片相邻的组织切片进行了snRNA-seq，以开展正交考证。Wang等东说念主从每个平台上开动的组织芯片中生成了pseudobulk基因抒发数据，并将其与癌症（TCGA）和普通（GTEx）组织样本的批量细胞RNA-seq数据进行比较，这些样本与空间成像分析所用的癌症和组织类型相匹配。
接洽东说念主员发现了什么？
Cook团队发现，Xenium数据在系数这个词动态范围内与snRNA-seq数据的关联性精熟，而且与CosMx比拟，Xenium数据的动态范围更宽，灵巧度更高（图3，上图）。在查验CosMx数据时，作家指出，“……低抒发基因昭着彭胀，导致其动态范围被压缩”。
Wang等东说念主强调了Xenium、MERSCOPE、CosMx与批量细胞RNA-seq数据之间的精熟关联性（图3，下图）。他们的数据也讲授低抒发转录本存在不异的潜在问题。他们叙述称，“……即使与正交数据比拟，CosMx也存在特征性的高涨，进一步标明CosMx数据中低抒发基因的假阳性率较高”。
图3. 专揽RNA-seq和snRNA-seq对空间成像分析性能进行基准测试。上图：Cook等东说念主强调，Xenium数据在Xenium的系数这个词动态范围内与snRNA-seq数据的关联性精熟，而且灵巧度高于CosMx。下图：Wang等东说念主标明，测试的系数三个平台齐与RNA-seq数据的关联性精熟，但指出CosMx在低抒发转录本上弘扬出特征性的高涨弧线，而Xenium检测每个基因时的灵巧度高于另两个平台。图片历程授权，改编自Cook et al., 2023和Wang et al., 2023。
Wang等东说念主还挑升比较了不同基因组合的灵巧度。具体来说，他们发现，“Xenium的乳腺基因组合（10 μm）检测的中位数抒发比MERSCOPE高2.6倍，肺部基因组合（5 μm）检测的中位数抒发高出13.6倍”。与CosMx比拟，Xenium的弘扬更佳，Wang等东说念主指出：
“关于肿瘤TMA中的相通基因，Xenium遥远弘扬出比CosMx更高的抒发水平，Xenium乳腺基因组合的计数比CosMx多种组织数据集高出14.6倍。Xenium多种组织基因组合的数据流清楚的互异略小，其中相通基因的抒发水平高出12.3倍，而肺部基因组合的数据是在切片后最接近的时刻点获取的，抒发中位数也高出14.0倍。”
作家得到了哪些启示？
咱们随后将两个平台的转录本品貌与匹配的snPATHO-seq进行比较。尽管这些计数是系数这个词群体的平均值，但咱们不雅察到Xenium数据在系数这个词检测范围内与snPATHO-seq数据的关联性精熟。比拟之下，CosMx数据在低抒发基因上弘扬出昭着的彭胀，导致其动态范围被压缩。因此，snPATHO-seq数据中收支三个数目级的基因在CosMx数据中弘扬出相似的检测法律解释。让情况愈加复杂的是高抒发基因的灵巧度指责，其回收水平低于在snPATHO-seq中不雅察到的水平。
——Cook等东说念主
专揽重复基因比较分析性能
为什么重复基因很紧迫？
基因组合上的基因总额（多重分析智商）会使某些贪图产生偏倚，包括每个细胞检测到的私有基因总额以及（单个细胞和系数这个词组织）检测到的转录本总额，尤其是在作家莫得筹商噪声的情况下。在不同平台上分析相通的基因以及高于噪声的转录本有助于更平直地比较分析性能。
作家在这些接洽中如何使用重复基因？
Cook等东说念主明确指出了重复基因的数目（125个），以及基因组合的总限度（Xenium检测377个基因，CosMx检测960个基因）。在比较可能受到多能分析智商影响的贪图（比如每个细胞检测到的私有基因数和每个基因的转录本中位数）时，他们提供了全体数据、按靶点数目归一化的数据，以及仅对共有基因进行比较的数据。
Wang等东说念主将Xenium和MERSCOPE的多个组织基因组合与CosMx进行比较，并指出在他们重心关切的六个基因组合中，共有基因特出94个，而且Xenium和MERSCOPE基因组合之间的相似度很高。与Cook的接洽相似，团队也叙述了系数基因和共有基因的贪图。
接洽东说念主员发现了什么？
与预期一致，在Cook的接洽中，CosMx基因组合飞动出的每个细胞的私有基因数要多于Xenium，因为它的多重分析智商更高。然则，在接洽系数基因中检测到的每个基因转录本中位数时，Xenium默契的每个基因的转录本数目粗略是CosMx的两倍。与这些法律解释一致，在仅限于基因组合之间共有的125个基因时，Xenium默契的每个细胞的转录本数目亦然CosMx的三倍（图4，左图）。
Wang等东说念主的分析法律解释与Cook接洽的法律解释一致。在比较Xenium、MERSCOPE和CosMx时，若筹商系数基因组合的基因，多重分析智商更高的CosMx基因组合在14种测试组织类型（所有20种）中检测到统统数目最多的私有基因。然则，Xenium不仅在另外6种样本类型中检测到统统数目更多的基因，而且在系数20种样本中检测到最高比例的on-panel基因，其次是MERSCOPE或CosMx（具体取决于样本类型）（图4，右图）。
图4. 检测到的转录本统统数目、检测到的基因比例和检测到的共有基因的性能比较。左图：Cook团队发现，多重分析智商更高的CosMx基因组合检测到的每个细胞中的转录本数目更多，但在只关切两个平台共有的转录本时，Xenium检测到的转录本数目约为CosMx的三倍。右图：Wang等东说念主标明，CosMx和Xenium分别默契了14种和6种组织类型中统统数目更多的基因。关于系数20种组织类型，Xenium齐检测到了更高比例的on-panel基因。图片历程授权，改编自Cook et al., 2023和Wang et al, 2023。
作家得到了哪些启示？
咱们发现，当分析仅限于共有基因时，Xenium检测到的每种组织类型的抒发水平齐较高，且在肿瘤组织或普通组织上的弘扬莫得昭着互异。
——Wang等东说念主
比较细胞分割、细胞聚类和空间结构
为什么这很紧迫？
单细胞空间成像本领需要可靠的细胞分割和转录本检测，以确保您梗概拿获单个细胞，并为其分拨正确的转录本。
作家在这些接洽中如何使用它？
Cook等东说念主专揽细胞异质性重心分析了基质，并查验了分割细胞中上皮细胞、成纤维细胞、肌细胞和巨噬细胞等的标识物。他们把柄组织中的细胞类型来表征空间结构。终末，他们试图检测一种荒漠的细胞类型（CD8 T细胞，通过CD3、CD8A和GZMA的共抒发界说）。
Wang等东说念主领先检测了数对非重复的标识物基因的抒发情况，并解释说精熟分割的细胞中成对抒发标识物基因的细胞比例应当很低。他们还把柄经典标识物检察了几种组织类型中每个平台梗概分辨的细胞类型。
接洽东说念主员发现了什么？
两项接洽齐强调，Xenium在细胞分割时所用的细胞核界限扩展*所产生的细胞遥远比CosMx和MERSCOPE更大。尽管如斯，Wang团队发现，Xenium梗概明晰分离以非重复标识物基因示意的细胞谱系（CD19和CD3e示意B细胞和T细胞，CD8和CD4示意T细胞亚群，CD3E和EPCAM示意上皮癌）。尽管MERSCOPE也能分辨这些细胞谱系，但CosMx只可分辨EPCAM和CD3E，而不行分辨其他基因对（作家臆度这可能是由于假阳性或细胞分割诞妄变成的，因为这些免疫基因的计数较低）。
Wang等东说念主发现，Xenium捕捉到的细胞类型遥远比CosMx更多（图5）。Xenium从每个乳腺、肺部和乳腺癌样本中飞动出9种不同的细胞类型。比拟之下，CosMx只可分别细则6种、6种和8种细胞类型，而且无法分辨出乳腺和肺部样本中系数已知的主要细胞类型。MERSCOPE从乳腺癌样本中飞动出6种细胞类型，接洽东说念主员指出，“……MERSCOPE和Xenium聚类之间的一双一映射比Xenium和CosMx聚类之间的映射更明晰”。
图5. 普通肺部组织中的细胞聚类和细胞类型。Xenium和CosMx回收的细胞类型的UMAP（左图）和空间散布（右图）。图片历程授权，改编自Wang et al., 2023。
以snRNA-seq算作基准真实值，Cook等东说念主发现Xenium数据中肌细胞的巨噬细胞和成纤维细胞标识物的比例高于预期。不异地，他们在周细胞中也发现了内皮细胞、肌细胞和成纤维细胞的标识物，他们臆度是周边细胞浑浊所致。在CosMx数据中，他们大意到标识物基因的特异性指责，并指出这可能是由于“在靶标识物的品貌较低和噪声水平较高，而不是分割诞妄”。
终末，Cook等东说念主试图专揽Xenium和CosMx检测CD8 T细胞。Xenium飞动出一个相应群体，但这个群体未出目下CosMx数据中（图6，左图）。此外，淋巴细胞（RNA含量低的小细胞）的标识物在Xenium的组织中呈点状抒发，而在CosMx SMI中，这些标识物散布在系数这个词组织中，不及以用于细胞表征（图6，右图）。
图6. 尝试专揽Xenium和CosMx分辨荒漠细胞类型。左图：CD3E（CD8 T细胞标识物）在系数这个词细胞簇中的抒发。右图：淋巴细胞标识物在相邻切片上的分割细胞中的抒发。图片历程授权，改编自Cook et al., 2023。
作家得到了哪些启示？
全体和组织聚类法律解释标明，CosMx也能识别主要细胞类型，但无法细则细胞亚型。此外，由于细胞簇富含的基因与已知的标识物无法对应（可能是由于灵巧度和特异性低导致抒发水平低），细胞类型扫视尤为穷苦。
——Wang等东说念主
*注：在开展这些接洽时，Xenium细胞分割的默许参数是细胞核向外扩展15 µm。这一距离目下也曾镌汰至5 µm，而且Xenium目下还提供专揽Xenium多模态细胞分割试剂盒进行情势学驱动的细胞分割选项。
强调这些法律解释的一致性
咱们不仅要关切这两项稀少接洽的法律解释，还要强调法律解释的一致性。尽管在正交基准测试时使用了不同器用、不同组织类型和不同方法，但这两项接洽发现：
Xenium弘扬出的特异性比CosMx更高（通过在靶基因相对阴性对照探针的百分比或FDR来掂量）。
Xenium在系数这个词动态范围内与snRNA-seq和RNA-seq的关联性精熟，而CosMx对低抒发转录本的计数有夸大景色（两篇论文齐明确强调了这少量）。
关于两个基因组合中共有的基因，Xenium检测到的转录本遥远比CosMx更多。
Xenium梗概检测到CosMx无法检测的细胞类型，包括淋巴细胞和荒漠/难以检测的细胞类型。
此外，两个接洽团队齐公开了他们的数据，以便重新分析和纳入夙昔的比较接洽。
比较接洽的局限性
一项计议精熟的接洽会强调其实践想象中的局限性。举例：
Cook等东说念主承认样本量有限，只包括别称患者的单个组织类型（不外作家后续正在开展一项更大限度的接洽）。筹商到组织类型和复杂性对分析性能的潜在影响，这是一个紧迫的筹商身分。此外，这项接洽（以及Wang等东说念主的接洽）重心关切FFPE组织，未在簇新冷冻样本（空间分析常用的另一种样本保存方法）上评估分析性能。
Wang等东说念主承认，组织切片和成像之间的时刻不相通。尽管他们尝试对每种本领的时刻点进行配对，但MERSCOPE组织的切片厚度比制造商建议的要薄，导致Xenium和MERSCOPE在配对时刻点上的比较可能不相通（不外他们按照制造商建议的厚度开动了另一组样本）。咱们在本篇著述中的大部分比较数据齐齐集在变化最小的样本上。他们还指出，为了让MERSCOPE基因组合与系数组织兼容，需要删除几个基因，这可能会影响其与Xenium的性能比较。
捕捉一幅更好意思满的图像：了解其他比较接洽
本文深远探讨了两项近期发表的稀少基准测试接洽，它们接管了不同的方法，但得出了相似的论断。最近还开展了另外两项接洽。
第一项稀少的接洽(3)由纽约基因组中心的Hartman和Satija衔尾。他们专揽基于Baysor的细胞分割政策，在小鼠大脑样本上比较了6种不同的单细胞空间成像本领（包括Xenium和MERSCOPE）。作家指出了他们的接洽有几个局限性，非常是他们只关切了单一组织类型（簇新冷冻小鼠大脑）中的单一剖解特征（皮层）。这项职责使用了单细胞空间成像平台和scRNA-seq分析的公开数据集，而不是对归并小鼠或神经剖解位置进行对比。
第二项接洽由NanoString辅助(4)，由好意思国西北大学的Dulai团队开展。他们的接洽比较了Xenium和CosMx在FFPE东说念主类回肠和结肠活检样本中的性能。尽管收集研讨会莫得谈到这项接洽的局限性或大意事项，但还有几点值得筹商：
莫得提供数据来掂量分析特异性和/或噪声（筹商到Cook等东说念主和Wang等东说念主在CosMx数据中不雅察到特异性总体偏低和‘高涨弧线’，这是一个关联的筹商身分）。
尽管使用了公开的scRNA-seq数据集来扫视细胞，但莫得使用正交本领来提供‘真实数据’，以比较两个平台和单个样本之间的分析性能。
作家指出，CosMx在细胞类型比例方面的可变性比Xenium小，但莫得提供每个平台检出细胞类型的准确性数据。
莫得流露UMAP中细胞聚类或细胞类型扫视的可视化法律解释，也莫得流露空间散布情况，因此很难细则是检出的细胞类型纠合在沿途照旧噪声假象。
作家称，不管RNA质地如何，CosMx的弘扬齐是一致的；不外文中只流露了16个样本中的5个样本，而且莫得承认CosMx数据与质地较高的样本存在负关联
作家宣称，CosMx检测到的每个细胞中的基因数是Xenium的6倍；这一说法并非由收集研讨会上的讲者提议，而是把柄每个基因组合上的系数基因（而不是重复基因）得出的，而况莫得说起高于噪声的基因百分比。
跟着多重分析、分析方法、细胞分割模态和软件等方面的高出，单细胞空间成像本领也在迅猛发展。这些接洽代表了作家在开展接洽时能战役到的本领，而了解著述发表后的本领高出可确保您采纳最顺应您需求的平台。
但愿深远了解单细胞成像平台之间的比较？迎接不雅看由David Cook和Luciano Martelotto博士主讲的收集研讨会！
要是您对咱们的产物和本领感酷好
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参考资源：
1. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.13.571385v1
2. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.07.570603v2
3. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.01.11.575135v1
4.